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分析ELISA實驗中非特異性顯色原因

更新時間:2017-05-18點擊次數(shù):1574
   影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物,操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測的特異性,并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。
  酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)自1971年自問世以來,以其敏感性高,特異性強,操作簡便、安全,而廣泛應用于臨床診斷,開創(chuàng)了免疫學診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性問題,本文就在實驗過程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施,消除非特異性顯色作一分析。
  一、試劑盒特異性因素
  1、固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證,評估。
  2、包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
  3、包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。
  4、封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
  二、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
  1、內(nèi)源性干擾物:類風濕因子(RF)、黃疸等,類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應,從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
  黃疸血標本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
  2、外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血,被細菌污染,標本凝集不全等。溶血標本,紅細胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標本在采集處理時應小心,在冰箱中保存不易過久。
  標本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。

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