關于蛋白電泳那些事2

更新時間：2021-08-18

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免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，是免疫學常用工具，主要應用于蛋白的定位、定性和定量。

其中 WB實驗是先通過進行跑電泳后，然后將分離好的蛋白質樣品轉移到固相載體上，再利用抗原-抗體-標記物顯色來檢測樣品，常用于定性和半定量。

圖｜ WB實驗流程圖
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WB實驗常見十問

1、細胞水平做WB，一般多少數量細胞提的蛋白夠做WB？做組織樣品的WB的時候,怎樣處理樣品？

答：一般5×10^6就足夠了；特殊情況需根據自己的研究來確定。

必須進行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫)，蛋白質溶解度會更好，離心要充分(12000轉/min，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

2、蛋白變性后可以存放多久？

答：-80℃，若沒有反復取出凍融，保存一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

3、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的WB檢測嗎？

答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品；有時如果抗體特異性高且效價高，同時使用2種一抗，可在一張膜上檢測2種不同蛋白。

4、上樣超載多少會對實驗有影響？可以用什么方法來增加上樣量？

答：正常超載30％不會有問題的，但不建議超載加樣。

可以濃縮樣品，或者根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白，還可以考慮加大膠的厚度，以增大上樣孔體積，比如嘗試1.5mm厚的膠。

5、我所測定的蛋白分子量是100KD左右，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會發生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預混膠、預制膠，詳情請參考“關于蛋白電泳那些事")

6、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？

答：WB一般上樣30-100μg不等，結果跟目的蛋白的表達豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。

最開始摸條件時，各個步驟都可以量多一點時間長一點(背景也容易就出來了)。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復測試。

7、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？

答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持冰浴，保持低溫。除非有文獻特別指明必須使用特殊方法，一般來說沒有區別。

8、轉膜后經麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜表現不是很好？

答：這是正常的，大分子的蛋白轉移很慢，你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡(轉過的表現)。注意一點：麗春紅染色較好，不是你的目標蛋白成功轉移至膜上的標準，只能作為一個粗略參考。

9、做半定量WB，內參β-actin，GAPDH哪個好？

答：一般選用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。

10、請問一下PVDF膜和NC膜的區別是什么？為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，有疏水作用但相對較弱，和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質相聯，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。

#土味情話大賽#

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活動時間：2021.8.10-2021.8.13

活動編號：Li210810H

活動范圍：全國生物相關終端客戶