PEI轉(zhuǎn)染試劑的配制步驟是什么?

　　PEI(聚乙烯亞胺)轉(zhuǎn)染試劑是一種高效、低成本的非脂質(zhì)體聚合物轉(zhuǎn)染試劑，廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及部分植物細(xì)胞的DNA、siRNA等核酸的轉(zhuǎn)染。其配制步驟需嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作，并注意濃度、pH值及儲(chǔ)存條件，以下是詳細(xì)的配制步驟及注意事項(xiàng)：
 

　　一、配制前準(zhǔn)備
 

　　材料與試劑
 

　　PEI粉末(分子量通常為25 kDa或40 kDa，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇)
 

　　超純水(或無(wú)內(nèi)毒素水)
 

　　1 M HCl(用于調(diào)節(jié)pH)
 

　　1 M NaOH(備用)
 

　　0.22 μm濾膜(無(wú)菌過(guò)濾用)
 

　　無(wú)菌離心管、移液器、磁力攪拌器(可選)
 

　　個(gè)人防護(hù)
 

　　佩戴實(shí)驗(yàn)服、手套和護(hù)目鏡，避免直接接觸PEI粉末(可能刺激皮膚和呼吸道)。
 

　　二、配制步驟
 

　　1. 溶解PEI粉末
 

　　計(jì)算質(zhì)量：根據(jù)目標(biāo)濃度(常用1 mg/mL)和所需體積，計(jì)算PEI粉末質(zhì)量。
 

　　示例：配制10 mL 1 mg/mL PEI溶液，需稱取10 mg PEI粉末。
 

　　溶解：將PEI粉末加入適量超純水(如5 mL)，渦旋或磁力攪拌至完全溶解(可加熱至50-60℃加速溶解，但需避免高溫破壞結(jié)構(gòu))。
 

　　定容：將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶或離心管，用超純水定容至目標(biāo)體積(如10 mL)。
 

　　2. 調(diào)節(jié)pH值
 

　　初始pH：PEI溶液初始pH通常較低(約1-2)，需用1 M HCl或NaOH調(diào)節(jié)至生理兼容范圍(pH 7.0-7.4)。
 

　　操作：
 

　　逐滴加入1 M NaOH，邊加邊攪拌，同時(shí)用pH試紙或pH計(jì)監(jiān)測(cè)，直至pH達(dá)7.0-7.4。
 

　　若pH過(guò)高，可用1 M HCl回調(diào)。
 

　　3. 無(wú)菌過(guò)濾
 

　　過(guò)濾：將調(diào)節(jié)好pH的PEI溶液通過(guò)0.22 μm濾膜無(wú)菌過(guò)濾，去除雜質(zhì)和微生物。
 

　　注意：
 

　　過(guò)濾前需確保濾膜和過(guò)濾裝置無(wú)菌。
 

　　若溶液體積較大，可分次過(guò)濾或使用真空過(guò)濾裝置。
 

　　4. 分裝與儲(chǔ)存
 

　　分裝：將過(guò)濾后的PEI溶液按實(shí)驗(yàn)需求分裝至無(wú)菌離心管(如1 mL/管)，避免反復(fù)凍融。
 

　　儲(chǔ)存：
 

　　短期使用(1-2周)：4℃保存。
 

　　長(zhǎng)期保存：-20℃或-80℃冷凍，可穩(wěn)定數(shù)月至一年。
 

　　避免反復(fù)凍融：每次取用后立即放回冷凍環(huán)境。
 

　　三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
 

　　濃度優(yōu)化
 

　　PEI濃度需根據(jù)細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化。常用范圍為1-10 μg/mL(按DNA質(zhì)量計(jì)算)，但需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳比例(如PEI:DNA質(zhì)量比為1:1至6:1)。
 

　　pH敏感性
 

　　PEI的轉(zhuǎn)染效率受pH影響顯著。pH過(guò)低(<6.5)可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性，pH過(guò)高(>7.5)可能降低轉(zhuǎn)染效率。
 

　　無(wú)菌操作
 

　　PEI溶液易受微生物污染，配制全過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌，避免影響細(xì)胞活性。
 

　　內(nèi)毒素控制
 

　　若用于敏感細(xì)胞(如原代細(xì)胞或干細(xì)胞)，建議使用無(wú)內(nèi)毒素水配制，并檢測(cè)內(nèi)毒素水平(<0.1 EU/mL)。
 

　　避免金屬離子污染
 

　　PEI可能與金屬離子(如Ca²?、Mg²?)結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染效率。配制時(shí)避免使用含金屬離子的試劑或容器。
 

　　四、預(yù)實(shí)驗(yàn)建議
 

　　細(xì)胞兼容性測(cè)試：首次使用前，在目標(biāo)細(xì)胞中測(cè)試PEI的細(xì)胞毒性(如MTT實(shí)驗(yàn))和轉(zhuǎn)染效率(如熒光報(bào)告基因)。
 

　　濃度梯度優(yōu)化：設(shè)置PEI濃度梯度(如1、2、4、6 μg/mL)，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
 

　　對(duì)照實(shí)驗(yàn)：設(shè)置空白對(duì)照(無(wú)PEI)和陽(yáng)性對(duì)照(已知高效轉(zhuǎn)染試劑)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可靠性。
 

　　五、PEI(聚乙烯亞胺)轉(zhuǎn)染試劑常見(jiàn)問(wèn)題解決

 

　　轉(zhuǎn)染效率低：檢查PEI濃度、pH值、細(xì)胞狀態(tài)及DNA質(zhì)量。
 

　　細(xì)胞毒性高：降低PEI濃度或縮短轉(zhuǎn)染時(shí)間，優(yōu)化轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)條件(如更換新鮮培養(yǎng)基)。
 

　　溶液渾濁或沉淀：可能因pH不當(dāng)或金屬離子污染導(dǎo)致，需重新配制并過(guò)濾。