細胞凍存液分類與選擇

　　細胞凍存是細胞生物學研究及藥物研發細胞實驗中需要經常面對的常規操作。隨著細胞越來越嬌，人工越來越貴，各種細胞凍存液應運而生，如何從名目繁多的細胞凍存液中選擇變成一個問題。本文從細胞凍存液分類，應用場景，使用效果等多方面加以闡釋，希望能對如何選擇細胞凍存液有所助益。

一、細胞凍存液的分類

1. 從成分劃分

（1）滲透性和非滲透性

　　滲透性保護劑分子量小可滲透到細胞內，如甘油、DMSO、乙二醇等，其在細胞冷凍存*凝固之前，滲入細胞內，降低細胞內外溶液中的電解質濃度，阻止細胞內水分外滲，避免細胞過分脫水皺縮，避免細胞內外環境冰晶的生成。
　　非滲透性保護劑不能滲透到細胞內，多為大分子物質，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白及羥、yi、ji淀粉(HES)等。這些大分子優先同溶液中的水分子結合，降低了細胞外自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶形成；同時，由于分子量大，使溶液中電解質濃度降低，減輕了溶質損傷。

　　DMSO是一類滲透性細胞凍存保護試劑的代表，這類試劑包括：甘油、DMSO、乙烯醇和乙酰胺等。從上述幾種物質滲透進出細胞的速度及細胞凍存效果看，DMSO效果更好，所以常規的細胞凍存液大都含有DMSO。DMSO在細胞凍存中保護細胞的原理是快速降低細胞內外電解質濃度、減少降溫通過冰點時冰晶產生進而保護細胞免受傷害。傳統的細胞凍存液是使用培養基、血清和DMSO按照一定的比例混合，其中DMSO的含量是10%。

（２）是否含血清

　　細胞凍存液含血清是從細胞生長環境角度考慮對細胞進行保護，但含血清（屬動物源成分）勢必需要考慮細胞污染、批間穩定性等因素，另外隨著細胞治療研究逐漸成為熱點，研究及生產過程的可預知、可控制要求，胎牛血清的使用液受到限制。包括李記生物在內的多家公司陸續開發成功不含血清的細胞凍存液，不含血清及動物來源性蛋白，減少病毒、霉菌和支原體等的污染。含血清的細胞凍存液一般采用程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），原因是血清中含有大量蛋白、細胞因子，血清含量較大的凍存細胞凍存液在溫度快速降低時，會造成有較多蛋白沉淀。

（３）是否含DMSO

　　作為滲透性細胞保護劑的代表，DMSO應用非常廣泛，DMSO可以快速滲透進入細胞，是非程序性降溫的基礎。但是DMSO在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，研究結果表明，培養液中DMSO濃度為10 %時，細胞生長抑制率近100 %；1%濃度時抑制率為35%，即使是0.04 %的濃度，DMSO對細胞的生長也有不利的影響。正是因為如此，細胞復蘇后需要離心去除DMSO。在一些臨床研究中，如果在細胞凍存中用到了DMSO，則需要說明其對細胞的毒副作用是否對細胞功能產生影響，也需要說明DMSO殘留的問題。DMSO替代物的開發也是從滲透與非滲透兩個方向研究，目前來看，滲透性的小分子化合物更具前景。李記生物從2015年開啟不含血清，不含DMSO的細胞凍存液產品的研發；第一代低DMSO得GMP級別凍存液已于2022年上市，詳情可關注李記生物微信公眾號文章-搜索“凍存液"。

2. 從操作過程劃分

　　是否需要程序降溫是細胞凍存中需要考慮的另一個因素。常規細胞凍存液采用培養基+血清+DMSO配置，一般需要采用程序降溫凍存細胞（先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個小時（或隔夜），最后才移至液氮罐中進行長期的儲存）。目前包括李記生物已經有多款新型細胞凍存液上市，不需要程序降溫，一步深凍，無需照看，節約了實驗時間。

二、細胞凍存液選擇

　　細胞凍存液的選擇須遵循幾個原則：①細胞在凍存和溶解過程中的損傷減低到最小，細胞存活率高；②凍存細胞復溫后，其的細胞生物學特性無明顯影響；③細胞復溫后，低溫保護劑容易去除，成分清楚，對細胞、人體無毒副作用；④凍存保護劑可快速起效，減少操作步驟；⑤價格。

三、注意事項

1. 常規細胞凍存液配方為基礎培養基（含10%胎牛血清）與DMSO按9:1配制。DMSO溶于培養基時，DMSO加入培養基將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配制，避免燙傷細胞。注意，不能直接在細胞培養液中添加DMSO。

2. 選擇不含DMSO的細胞凍存液時，需確認替代成分的物質基礎，如果替代成分較DMSO潛在危害更大，則得不償失。

3. 選用不含DMSO的細胞凍存液，需確認無細菌及細胞污染，要進行支原體檢測。