Pikogreen熒光染料使用方法

更新時間：2018-05-25

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使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管），實驗當天，根據實驗需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時內使用。

2. 配制標準品DNA溶液

1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時的吸光度確定DNA 濃度；相應于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標準液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對照處理，被用來做標準曲線的dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理，并且應該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復8 個點的標準曲線。配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同體積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1: 用1 x 1cm 比色杯時DNA 標準濃度配制參考

標準DNA 溶液濃度（ng/mL）	標準DNA 溶液體積（mL）	PikoGreen 工作液體積（mL）	標準DNA 終濃度(ng/mL)
1000	1	1	500
200	1	1	100
50	1	1	25
20	1	1	10
5	1	1	2.5
2	1	1	1
1	1	1	0.5
0	1	1	空白

3) 當用微量檢測皿適配器時，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內完成。產生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標準曲線，配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經常可以驅散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2：用微量檢測皿DNA 標準濃配制參考

標準DNA 溶液濃度（ng/mL）	標準DNA 溶液體積（mL）	PikoGreen 工作液體積（mL）	標準DNA 終濃度(ng/mL)
200	30	30	100
50	30	30	25
20	30	30	10
5	30	30	2.5
2	30	30	1
0	30	30	空白

4) 孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應保持所有樣品的檢測時間一致。用熒光值zui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測數據與DNA標準溶液濃度做回歸分析，制作標準曲線。

3. 樣品分析

1) 用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法吸取的情況。

2) 在每個樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度。可以對樣品進行不同的稀釋處理重復測定以確保結果的準確性。